Produzione di proteine ricombinanti
La piattaforma per la produzione di proteine ricombinanti è un’infrastruttura integrata, una rete che unisce laboratori di diversi enti, combinando competenze multidisciplinari e risorse tecnologiche avanzate. Questa rete consente la selezione, lo sviluppo e la produzione di proteine e glicoproteine innovative, con applicazioni che spaziano dalla creazione di nuovi antigeni alla produzione di farmaci biotecnologici per l’immunoterapia di malattie infettive e tumori. Grazie a strutture all’avanguardia e a un know-how consolidato, la piattaforma rappresenta un punto di riferimento per la ricerca e lo sviluppo di soluzioni biotecnologiche su misura.
Partners
- Università degli studi dell’Insubria
- Università degli studi di Pavia
- IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia
- Scuola Normale Superiore
Laboratori:
- Lab HEK293
- Lab CHO
- Lab cellule microbiche
- Lab hMAb
Produzione di proteine ricombinanti in cellule CHO
Questa piattaforma rappresenta un’infrastruttura all’avanguardia per la produzione di proteine ricombinanti in cellule di ovaio di criceto cinese (CHO), destinate a studi preclinici e applicazioni biotecnologiche.
Il laboratorio è stato costruito per garantire la massima efficienza e qualità nei processi di espressione e purificazione delle proteine ricombinanti. L’integrazione di tecnologie avanzate e il rigoroso controllo delle condizioni operative permettono di ottimizzare ogni fase della produzione, assicurando elevata riproducibilità e standard qualitativi eccellenti.
Il laboratorio è dotato di un incubatore in grado di mantenere condizioni controllate di temperatura, umidità e concentrazione di CO₂, essenziali per la crescita ottimale delle colture cellulari. A supporto delle attività di coltura cellulare, sono presenti anche una cappa biologica per la manipolazione in ambiente sterile, una centrifuga, un bagnetto termostatico per il mantenimento di temperature costanti, un microscopio e un conta cellule automatico.
La piattaforma include inoltre un sistema di ultrafiltrazione (Millipore), impiegato per la concentrazione e purificazione delle proteine. Completa l’infrastruttura un bioreattore (Cytiva, WAVE 25) avanzato, progettato per la crescita su larga scala delle cellule CHO, con un controllo preciso e automatizzato dei parametri chiave, quali pH, temperatura, ossigenazione e concentrazione di nutrienti. Questo sistema consente di massimizzare la produzione di proteine ricombinanti, garantendo condizioni altamente riproducibili e ottimizzate per applicazioni biotecnologiche e farmaceutiche.
Produzione di proteine ricombinanti in cellule microbiche
La piattaforma di produzione di proteine ricombinanti in cellule microbiche supporta la produzione di proteine ricombinanti in batteri (Gram-positivi e Gram-negativi), lieviti e insetti. Grazie a un’infrastruttura avanzata, consente esperimenti su diverse scale, dal laboratorio alla produzione su media scala, garantendo un controllo preciso dei parametri critici del processo.
L’impiego di bioreattori di ultima generazione, con monitoraggio continuo di parametri come pH, temperatura, ossigenazione e concentrazione di nutrienti regolabili in tempo reale, assicura condizioni ottimali per la crescita cellulare e l’espressione proteica. Uno dei principali punti di forza della piattaforma è la sua elevata flessibilità, che consente di adattarsi a diverse specie microbiche, ottimizzando le condizioni per ogni specifico sistema ospite. Questo approccio permette non solo di migliorare le rese produttive, ma anche di ottenere proteine con caratteristiche biochimiche ottimali per applicazioni industriali, farmaceutiche e biotecnologiche. Grazie a protocolli scalabili e riproducibili, la piattaforma facilita il trasferimento tecnologico dalla ricerca alla produzione industriale, accelerando lo sviluppo di nuovi bioprodotti.
La dotazione include sei autoclavi fino a 150 L, due cappe sterili a flusso laminare, stereomicroscopi e microscopi ottici (ingrandimento fino a 100X), un incubatore per piastre, tre shaker termostatati e una stanza a temperatura controllata con shaker per fermentazioni su scala di beuta. A questi si aggiungono tre biofermentatori da 3 L (P100 Applikon, volume operativo massimo 2 L) con elettrodi per il monitoraggio continuo di pH, temperatura, livello e dO₂, è un bioreattore Livit Flex (Getinge) da 7 L (5,5 L massimo volume operativo) con software SCADA per il pieno controllo del processo fermentativo.
Purificazione delle proteine
In aggiunta alle facilities per l’upstream, entrambe le piattaforme dispongono anche di strumentazione necessaria per la fase di downstream quali sistemi di recupero dei brodi di fermentazione e di lisi cellulare, e sistemi per la purificazione e analisi delle proteine ricombinati.
Per la purificazione, dispone di sistemi FPLC ÄKTA Purifier ed Explorer, che assicurano un’elevata efficienza nella separazione delle proteine. L’analisi e caratterizzazione biochimica è supportata da sistemi elettroforetici, spettrofotometri, uno spettrofluorimetro e uno spettropolarimetro (Jasco) per lo studio della conformazione e della purezza delle biomolecole.
Per la quantificazione di metaboliti e prodotti di reazione sono disponibili un lettore di assorbanza, fluorescenza e luminescenza per piastre a 96 pozzetti (Tecan), oltre a sistemi HPLC e GPC (Jasco) per la separazione e caratterizzazione delle biomolecole. Inoltre, la piattaforma integra un sistema automatizzato di high-throughput screening (Opentrons), che, combinato con il lettore Tecan, permette di eseguire dosaggi enzimatici e saggi di inibizione su larga scala.
Questa combinazione di strumenti di ultima generazione consente di ottenere proteine ricombinanti di alta qualità, ottimizzando produttività e affidabilità dei risultati.
Strumentazione
Strumenti per la produzione di proteine ricombinanti in cellule CHO
Bioreattore (Cytiva, ReadyToProcess WAVE25)
Offre un ambiente controllato per la produzione efficiente di proteine ricombinanti, regolando con precisione pH, ossigenazione, temperatura e nutrienti. L’automazione e il monitoraggio in tempo reale garantiscono alta riproducibilità e resa ottimale.
Sistemi di ultrafiltrazione (Millipore)
Sono utilizzati per la concentrazione e la filtrazione delle proteine, permettendo di rimuovere impurità, sali e altre piccole molecole. Grazie a membrane a permeabilità selettiva, questi sistemi consentono anche lo scambio di tamponi senza danneggiare le proteine, preservando la loro integrità e attività biologica.
Sistemi di ultrafiltrazione (Millipore)
Sono utilizzati per la concentrazione e la filtrazione delle proteine, permettendo di rimuovere impurità, sali e altre piccole molecole. Grazie a membrane a permeabilità selettiva, questi sistemi consentono anche lo scambio di tamponi senza danneggiare le proteine, preservando la loro integrità e attività biologica.
Strumenti per la produzione di proteine ricombinanti in cellule microbiche
Biofermentatori da 3 L (P100 Applikon)
Con un volume operativo massimo di 2 L per ciascun fermentatore, sono ideali per la coltura di cellule e la produzione di biomolecole su scala ridotta. Equipaggiati con elettrodi per il monitoraggio continuo di parametri cruciali come pH, temperatura, livello del liquido e concentrazione di ossigeno disciolto (dO2), questi fermentatori offrono un controllo preciso e in tempo reale delle condizioni di coltura, ottimizzando la crescita cellulare e l’espressione proteica in ambienti controllati.
Bioreattore Livit Flex (Getinge)
Da 7 L con 5,5 L di massimo volume operativo è progettato per offrire un controllo avanzato e preciso nei processi fermentativi. Grazie al software SCADA integrato, consente il monitoraggio e la gestione in tempo reale di parametri chiave (pH, temperatura, ossigeno disciolto, nutrienti) assicurando condizioni ottimali. Questo bioreattore è ideale per applicazioni di ricerca, sviluppo e produzione su piccola scala, garantendo una elevata riproducibilità e un’accurata gestione del processo
Bioreattore Livit Flex (Getinge)
Da 7 L con 5,5 L di massimo volume operativo è progettato per offrire un controllo avanzato e preciso nei processi fermentativi. Grazie al software SCADA integrato, consente il monitoraggio e la gestione in tempo reale di parametri chiave (pH, temperatura, ossigeno disciolto, nutrienti) assicurando condizioni ottimali. Questo bioreattore è ideale per applicazioni di ricerca, sviluppo e produzione su piccola scala, garantendo una elevata riproducibilità e un’accurata gestione del processo
Strumenti per la purificazione e analisi di proteine ricombinanti
Sistemi FPLC ÄKTA Purifier e Explorer
Offrono un’elevata efficienza e riproducibilità nella purificazione di proteine ricombinanti. Grazie al controllo preciso di parametri critici come pH, salinità e gradiente di eluizione, e all’automazione avanzata, garantiscono alta purezza e resa del campione. La loro modularità li rende adatti a diverse strategie cromatografiche di purificazione, inclusi scambi ionici, affinità e filtrazione su gel.
Spettrofotometri UV/Vis (Jasco)
Offrono un’elevata efficienza e riproducibilità nella purificazione di proteine ricombinanti. Grazie al controllo preciso di parametri critici come pH, salinità e gradiente di eluizione, e all’automazione avanzata, garantiscono alta purezza e resa del campione. La loro modularità li rende adatti a diverse strategie cromatografiche di purificazione, inclusi scambi ionici, affinità e filtrazione su gel.
Spettrofotometri UV/Vis (Jasco)
Offrono un’elevata efficienza e riproducibilità nella purificazione di proteine ricombinanti. Grazie al controllo preciso di parametri critici come pH, salinità e gradiente di eluizione, e all’automazione avanzata, garantiscono alta purezza e resa del campione. La loro modularità li rende adatti a diverse strategie cromatografiche di purificazione, inclusi scambi ionici, affinità e filtrazione su gel.
Spettropolarimetro (Jasco)
Consente l’analisi della struttura secondaria delle proteine mediante dicroismo circolare, fornendo informazioni fondamentali sulla loro conformazione e stabilità. Grazie all’elevata sensibilità e precisione, è ideale per valutare variazioni strutturali dovute da mutazioni, interazioni con ligandi, effetti di temperatura o pH, e processi di denaturazione.
Spettrofluorimetro (Jasco)
consente l’analizzi della conformazione, la stabilità e le interazioni delle proteine tramite la misurazione dell’emissione di fluorescenza. E utilizzato per studiare variazioni strutturali, il legame con ligandi e e l’influenza di fattori ambientali come pH e temperatura. Inoltre, trova ampio impiego in saggi di fluorescenza per analisi enzimatiche, studi di affinità e dinamiche conformazionale.
Spettrofluorimetro (Jasco)
consente l’analizzi della conformazione, la stabilità e le interazioni delle proteine tramite la misurazione dell’emissione di fluorescenza. E utilizzato per studiare variazioni strutturali, il legame con ligandi e e l’influenza di fattori ambientali come pH e temperatura. Inoltre, trova ampio impiego in saggi di fluorescenza per analisi enzimatiche, studi di affinità e dinamiche conformazionale.
Sistemi HPLC e GPC (Jasco)
Consentono la separazione e l’analisi di proteine, peptidi e metaboliti. L’HPLC offre elevata risoluzione e sensibilità per la determinazione della purezza e della composizione del campione, mentre la GPC consente la separazione in base alla dimensione molecolare, permettendo la caratterizzazione del peso molecolare e dello stato di aggregazione delle proteine. Queste tecniche sono fondamentali per studi di stabilità, controllo qualità e analisi delle interazioni biomolecolari.
Sistema automatizzato di liquid-handling e lettore di piastre (Opentrons OT-2)
Combina la gestione automatizzata dei liquidi con la lettura di piastre multi-pozzetto, consentendo l’esecuzione di high-throughput screening per saggi enzimatici e di inibizione. Grazie all’elevata precisione nella dispensazione dei reagenti e alla capacità di analizzare simultaneamente numerosi campioni, ottimizza il flusso di lavoro, riducendo il rischio di errori e migliorando la riproducibilità dei risultati.
Sistema automatizzato di liquid-handling e lettore di piastre (Opentrons OT-2)
Combina la gestione automatizzata dei liquidi con la lettura di piastre multi-pozzetto, consentendo l’esecuzione di high-throughput screening per saggi enzimatici e di inibizione. Grazie all’elevata precisione nella dispensazione dei reagenti e alla capacità di analizzare simultaneamente numerosi campioni, ottimizza il flusso di lavoro, riducendo il rischio di errori e migliorando la riproducibilità dei risultati.
Lettore di assorbanza, fluorescenza e luminescenza per piastre a 96 pozzetti (Tecan Infinite 200PRO)
È ideale per la quantificazione di metaboliti e prodotti di reazione in saggi biochimici e biologici. Grazie alla capacità di misurare assorbanza, fluorescenza e luminescenza, supporta un’ampia gamma di applicazioni, tra cui dosaggi enzimatici e saggi di legame. La compatibilità con piastre a 96 pozzetti permette l’analisi simultanea di numerosi campioni, rendendolo ideale per screening ad alta produttività e studi su larga scala.
Lista dei ceppi di espressione di E. coli disponibili
| CEPPO | DESCRIZIONE | RESISTENZA | UTILIZZO |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3) | Ceppo standard per l’espressione di proteine con T7 RNA polimerasi | Ø | Espressione proteica generica |
| BL21(DE3) LOBSTR | Ingegnerizzato per ridurre l’espressione di proteine di background tramite l’eliminazione delle proteasi Lon e OmpT | Ø | Espressione di proteine soggette a degradazione |
| BL21(DE3)pLysS | Contiene un plasmide con il lisozima T7, che inibisce l’attività basale della T7 RNA polimerasi. | Cloramfenicolo | Espressione di proteine tossiche |
| BL21(DE3)RIL | Contiene un plasmide che codifica per tRNA specifici per codoni rari (Arg, Ile, Leu) | Cloramfenicolo | Espressione migliorata di proteine eucariotiche con codoni rari |
| BL21(DE3)Star | RNasi E mutata per stabilizzare l’mRNA | Ø | Aumentata stabilità dell’mRNA ed espressione proteica |
| BL21CodonPlus(DE3)RIL | Ingegnerizzato per contenere copie aggiuntive di tRNA per codoni rari (Arg, Ile, Leu). | Cloramfenicolo | Espressione potenziata di proteine eucariotiche con codoni rari |
| BL21CodonPlusRIL | Simile a BL21CodonPlus(DE3)RIL, ma privo del lisogeno DE3. | Cloramfenicolo | Espressione ottimizzata di geni con codoni rari |
| BL21pLysE | Contiene il plasmide pLysE che codifica il lisozima T7 per ridurre l’espressione basale. | Cloramfenicolo | Adatto per l’espressione di proteine tossiche |
| C41(DE3) pRIL | Derivato da BL21(DE3), ottimizzato per l’espressione ad alta resa di proteine difficili, con tRNA per codoni rari. | Cloramfenicolo | Espressione di proteine tossiche o di membrana |
| Lemo21(DE3) | Derivato da BL21(DE3), ottimizzato per l’espressione ad alta resa di proteine difficili, con tRNA per codoni rari. | Cloramfenicolo | Espressione controllata di proteine complesse |
| Origami (DE3) pLysS | Mutazioni nei geni trxB e gor per migliorare la formazione di ponti disolfuro nel citoplasma. | Tetraciclina, Cloramfenicolo | Espressione di proteine che richiedono ponti disolfuro |
| Origami 2(DE3) | Simile a Origami (DE3) ma con mutazioni migliorate nei geni trxB e gor. | Kanamicina, Tetraciclina | Migliore ripiegamento di proteine con ponti disolfuro nel citoplasma |
| Origami B (DE3) | Mutazioni nei geni trxB e gor, simili ai ceppi Origami. | Kanamicina | Adatto per l’espressione di proteine con ponti disolfuro |
| Origami B(DE3)pLysS | Combinazione di Origami B (DE3) con pLysS per un controllo più stretto dell’espressione proteica. | Kanamicina, Cloramfenicolo | Adatto per l’espressione di proteine con ponti disolfuro |
| Rosetta 2(DE3)pLysS | Geni tRNA migliorati per codoni rari, con pLysS per un controllo più preciso dell’espressione. | Kanamicina, Cloramfenicolo | Espressione di proteine eucariotiche con codoni rari |
| Rosetta-gami (DE3) pLysS | Combina tRNA per codoni rari con mutazioni che favoriscono la formazione di ponti disolfuro. | Kanamicina, Cloramfenicolo, Tetraciclina | Espressione di proteine complesse che richiedono codoni rari e ponti disolfuro |
| Rosetta-gami B(DE3)pLysS | Unisce le caratteristiche dei ceppi Rosetta con le capacità di Origami per la formazione di ponti disolfuro. | Kanamicina, Cloramfenicolo | Espressione di proteine eucariotiche con codoni rari e ponti disolfuro |
Lista di streptomiceti disponibili come piattaforme di espressione proteica
| CEPPO | DESCRIZIONE | RESISTENZA | UTILIZZO |
|---|---|---|---|
| Streptomyces albus J1074 | Ceppi caratterizzati da alte capacità di secrezione | Ø | Consigliati per la produzione di proteine di origine microbica, soprattutto per proteine di difficile espressione in forma solubile in E. coli |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | |||
| Streptomyces ghanensis ATCC 14672 | |||
| Streptomyces lividans TK24 | |||
| Streptomyces venezuelae ATCC 10595 |
Lista dei plasmidi di espressione disponibili
| VETTORE | RESISTENZA | PROMOTER | FUSION TAGS | SITO DELLA PROTEASI |
|---|---|---|---|---|
| pBR328 | Ampicillina | lac | Ø | Ø |
| pCold I | Ampicillina | cspA (cold shock) | His-tag | Factor Xa |
| pET11a | Ampicillina | T7 | Ø | Ø |
| pET20b+ | Ampicillina | T7 | His-tag (C-terminal) | Ø |
| pET21+ | Ampicillina | T7 | His-tag (C-terminal) | Ø |
| pET21b con inserto in Nde/Xho | Ampicillina | T7 | His-tag (C-terminal) | Ø |
| pET22b | Ampicillina | T7 | His-tag (C-terminal) | Ø |
| pET24b+ | Kanamicina | His-tag (C-terminal) | Ø | |
| pET26b+ | Kanamicina | T7 | His-tag (N-terminal), pelB signal sequence | Ø |
| pET28a con inserto in NdeI/XhoI | Kanamicina | T7 | His-tag (N-terminal) | trombina, enterokinasi |
| pET29b con inserto in NdeI/Xho | Kanamicina | T7 | His-tag (C-terminal) | trombina, enterokinasi |
| pET32b | Ampicillina | T7 | His-tag (N-terminal), Trx-tag | trombina, enterokinasi |
| pET39b+ | Kanamicina | T7 | DsbA (N-terminal), His-tag (C-terminal) | Ø |
| pET9c | Kanamicina | T7 | Ø | Ø |
| pET-DUET | Ampicillina | T7 | Ø | Ø |
| pGex-6p-2 | Ampicillina | tac | GST | PreScission |
| pG-Tf2 | Cloramfenicolo | GroESL | His-tag | Ø |
| pKJE7 | Cloramfenicolo, Kanamicina | arabinose (araBAD promoter) | Ø | Ø |
| pKK233-3 | Ampicillina | tac | Ø | Ø |
| pMM1525 | Ampicillina | trc | Ø | Ø |
| pPT7 | Ampicillina | T7 | Ø | Ø |
| pRSET A | Ampicillina | T7 | His-tag (N-terminal), Xpress epitop | enterokinasi |
| pT7 | Ampicillina | T7 | Ø | Ø |
| pT7-deltaBam-Hind | Ampicillina | T7 | Ø | Ø |
| pTrc99A | Ampicillina | trc | Ø | Ø |