Piattaforma ImmunoFarmaVitro
La piattaforma ImmunoFarmaVitro è costituita da facilities e strutture afferenti a diversi enti che mettono a disposizione i propri laboratori e le proprie competenze per la caratterizzazione immunofarmacologica di composti biologici.
Tale network multidisciplinare consente di analizzare e di valutare attività ed efficacia di vari bioprodotti, al fine di screenare ed individuare molecole che possano rappresentare candidati da utilizzare a scopo terapeutico in diversi contesti di alterazione fisiologica, quali malattie infettive e tumori.
Partners:
- Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia
- Università degli studi di Pavia
- Università degli studi di Roma Tor Vergata
- ASST Fatebenefratelli Sacco di Milano
Attività offerte dalla piattaforma
A. Screening e valutazione dell’attività farmacologica di farmaci biologici
L’efficacia farmacologica dei bioprodotti può essere valutata in vitro in modelli cellulari 2D o 3D (organoidi o sferoidi) sviluppati a partire da cellule primarie tumorali.
In particolare, possono essere valutati i seguenti parametri:
• A1. Effetto citotossico: può essere misurato in citometria o tramite saggi di vitalità (MTT, LDH) come mortalità delle cellule trattate con il bioprodotto.
Inoltre, nel caso in cui il bioprodotto sia costituito da un anticorpo, può essere valutata la sua capacità di mediare l’attivazione di cellule immunitarie effettrici e la loro attività citotossica (ADCC) sulle cellule target. In questo caso, le analisi vengono eseguite mediante citometria a flusso per le colture 2D e tramite imaging utilizzando marcatori di morte cellulare se si tratta di colture 3D.
• A2. Inibizione della proliferazione cellulare: può essere valutata mediante citofluorimetria per colture 2D utilizzando molecole fluorescenti che si intercalano al DNA cellulare e permettono di misurare la proliferazione delle cellule.
Per organoidi o sferoidi si può usare il saggio della luciferasi basato sull’ATP.
• A3. Analisi del trascrittoma: valutazione del trascrittoma bulk e single cell completo e dei repertoires TCR e BCR delle cellule immunocompetenti e/o tumorali trattate con il bioprodotto.
• A4. Capacità anti-metastatica valutata mediante analisi della riduzione dell’attività migratoria delle cellule tumorali e della capacità loro invasiva.
B. Valutazione della risposta immunitaria ex-vivo
Gli aspetti fenotipici e funzionali delle cellule del sistema immunitario innato e adattativo vengono valutati in condizione patologiche di carattere infettivo (tubercolosi, COVID-19) o di carattere tumorale.
• B1. Cellule dendritiche e macrofagi: ne viene misurata l’attivazione in seguito ad esposizione ad antigeni. Viene inoltre valutata la loro capacità di fagocitare l’antigene e presentarlo. Questi tests vengono condotti mediante analisi citofluorimetriche, di imaging e saggi di produzione di citochine (PCR, Multiplex ELISA).
• B2. Linfociti T: viene misurata la loro risposta a stimoli antigenici mediante tests di proliferazione (citofluorimetria) e di produzione di citochine (saggi ELISPOT). In particolare possono essere studiate, oltre ai T circolanti nel sangue periferico, le cellule T nasali residenti per verificare la “nasal Immunity” valutando la risposta T all’esposizione con antigeni virali.
• B3. Linfociti B: viene valutata la loro capacità di produrre immunoglobuline mediante saggi ELISA ed ELISPOT dopo stimolazione con bioprodotti o a antigeni virali.
C. Determinazione di affinità Antigene-Anticorpo
Mediante CE, Affinity Chromatography, SPR.
La cromatografia a esclusione molecolare (SEC) può essere impiegata per valutare l’affinità antigene-anticorpo monitorando la formazione e la stabilità dei complessi immunologici: le frazioni contenenti il complesso, rispetto a quelle con molecole libere, mostrano un peso molecolare maggiore e quindi tempi di eluizione distinti. In modo complementare, la capillary electrophoresis (CE) consente la separazione ad alta risoluzione tra anticorpi, antigeni e i loro complessi sulla base della differenza di mobilità elettroforetica, permettendo una quantificazione precisa dei legami formati. Entrambe le tecniche, pur non fornendo direttamente i parametri cinetici, permettono di stimare l’affinità in base all’equilibrio tra forme libere e complesse in condizioni controllate.
Il Biacore T200, basato su tecnologia SPR, viene utilizzato per studiare in tempo reale le interazioni tra biomolecole, come ad esempio tra un recettore e il suo ligando, un anticorpo e il suo antigene, o una proteina e una piccola molecola. Questo strumento consente di determinare parametri cinetici (velocità di associazione e dissociazione), affinità (KD), e in alcuni casi anche informazioni termodinamiche. L’attività si basa sull’immobilizzazione di una delle due molecole su una superficie sensibile e sul passaggio controllato della seconda molecola in soluzione, permettendo di osservare l’interazione senza l’uso di marcatori fluorescenti o radioattivi. È uno strumento chiave per la caratterizzazione di farmaci, anticorpi terapeutici, biomarcatori e per studi di base su meccanismi molecolari.
D. Valutazione della capacità neutralizzante e neuroprotettiva di mAbs
• D.1 La capacità neutralizzante esercitata da anticorpi monoclonali, ossia l’effetto di bloccare l’ingresso di un virus nella cellula ospite, viene misurata mediante saggio di inibizione dell’effetto citopatico indotto dal virus su cellule sensibili all’infezione.
Nel caso di SARS-CoV-2, le cellule target impiegate sono le Vero-E6 che, esprimendo il recettore ACE2, risultano infettabili dal virus. Dopo infezione, viene misurata la morte cellulare tramite l’utilizzo di un tracciante che rileva le cellule morte.
I test che richiedono la manipolazione di virus vengono eseguiti in laboratori a livello di biosicurezza 3.
• D2. A livello funzionale, viene valutata l’attività neutralizzante degli anticorpi monoclonali mediante utilizzo di modelli ex-vivo. Fettine ippocampali ex-vivo vengono trattate con la proteina Spike di SARS-CoV-2, quindi la capacità neuroprotettiva degli anticorpi monoclonali viene valutata studiando, con metodiche elettrofisiologiche, i meccanismi di plasticità sinaptica che risultano essere alterati nei processi neuroinfliammatori.
Dotazione strumentale della piattaforma
La piattaforma prevede l’integrazione di strumenti utilizzati in diverse aree di attività:
1. Area Biologia Cellulare (livello sicurezza II e III)
Prevede l’utilizzo di cappe a flusso laminare per la manipolazione di campioni biologici in sterilità e in sicurezza, incubatori a CO2 per il mantenimento di colture cellulari, microscopi ottici dotati di fotocamera digitale che permette di monitorare e documentare l’andamento di colture cellulari, centrifughe refrigerate e microcentrifughe, Lettore per saggi ELISA, Lettore per saggi ELISPOT.
2. Area Biologia Molecolare
Comprende strumentazione utile all’analisi molecolare quale Thermal cycler, Digital droplet PCR e real-time PCR.
3. Area Trascrittomica
Si avvale del BD Rhapsody™ Single cell RNA analysis system che permette di analizzare l’intero trascrittoma delle singole cellule, così come quello di TCR e BCR. Questo tipo di analisi fornisce informazioni riguardanti i principali geni e pathways attivati nei diversi clusters cellulari. Consente inoltre di analizzare il tipo e l’intensità delle comunicazioni cellulari che si instaurano tra i clusters.
4. Area Analisi per Imaging
Prevede l’utilizzo di sistemi di imaging come l’Apparecchiatura per acquisizione di immagini ChemiDoc per l’imaging di gel elettroforetici e Western blot. Le analisi su cellule e tessuti possono essere condotte da un sistema di imaging da ricerca (MICA, Leica Microsystems) completamente automatizzato (inbox con microscopio invertito) con tre modalità di imaging in base alle esigenze:
1 – Imaging in campo chiaro a luce trasmessa; 2 – imaging in fluorescenza standard che include anche la tecnologia THUNDER; 3 – imaging confocale point scanning che include modulo LIGHTNING.
5. Area Analisi di Citometria
Grazie all’utilizzo di un citofluorimetro dotato di 3 laser, è possibile eseguire analisi fenotipiche e funzionali multiparametriche di numerosi subsets cellulari combinando fino a 12 fluorescenze diverse.
6. Area Analisi di Spettrofotometria
Le analisi possono essere condotte tramite lo strumento Cytiva Biacore T200 basato sulla risonanza plasmonica di superficie (SPR) che consente l’analisi, in tempo reale e senza marcatori, di interazioni biomolecolari (proteine, anticorpi, piccole molecole, virus) con straordinaria sensibilità e precisione.
7. Area Elettrofisiologia
La strumentazione in dotazione permette di analizzare e studiare i meccanismi di plasticità sinaptica in modelli ex-vivo costituiti ad esempio da fettine ippocampali trattate con proteine virali.
1. Area Biologia Cellulare
Lettore ELISA
Biochrom EZ Read 400 è un lettore di piastre progettato per analisi basate su assorbanza, compatibile con piastre standard da 96 pozzetti. Consente la lettura dell’assorbanza in un ampio intervallo di lunghezze d’onda (405, 450, 492, 562, 570, 595, 620, 650 nm), coprendo così la maggior parte delle esigenze per saggi ELISA, saggi enzimatici, dosaggio di proteine e acidi nucleici.
Lettore ELISPOT Mabtech ASTOR™
È un lettore ELISpot ad alta precisione progettato per l’analisi automatica di piastre a 96 pozzetti. Utilizza una fotocamera CMOS con messa a fuoco fissa e un sistema di illuminazione a LED bianco per immagini uniformi e nitide. È dotato del software Mabtech Apex™, che integra l’algoritmo RAWspot™ per il riconoscimento affidabile degli spot, anche ad alta densità (>3000 spot/pozzetto). Il sistema legge una piastra in meno di 2 minuti, esporta i dati in vari formati (XLSX, JPEG, PZFX) ed è compatibile con automazione e validazione normativa (IQ/OQ/PQ, CFR 21 part 11). È ideale per laboratori che richiedono efficienza, ripetibilità e tracciabilità nei test immunologici.
Lettore ELISPOT Mabtech ASTOR™
È un lettore ELISpot ad alta precisione progettato per l’analisi automatica di piastre a 96 pozzetti. Utilizza una fotocamera CMOS con messa a fuoco fissa e un sistema di illuminazione a LED bianco per immagini uniformi e nitide. È dotato del software Mabtech Apex™, che integra l’algoritmo RAWspot™ per il riconoscimento affidabile degli spot, anche ad alta densità (>3000 spot/pozzetto). Il sistema legge una piastra in meno di 2 minuti, esporta i dati in vari formati (XLSX, JPEG, PZFX) ed è compatibile con automazione e validazione normativa (IQ/OQ/PQ, CFR 21 part 11). È ideale per laboratori che richiedono efficienza, ripetibilità e tracciabilità nei test immunologici.
Bio-Plex 200 System
BIO-RAD è una piattaforma integrata per analisi quantitative multiparametriche (Multiplexing) di molecole biologiche in sospensione, sia di proteine che di acidi nucleici. Il sistema è progettato per permettere l’analisi simultanea di un rilevante numero di differenti analiti (fino a 100) all’interno dello stesso campione. Lo strumento sfrutta la tecnologia della citometria a flusso integrando componenti di rilevazione ottica, fluidica e processazione del segnale digitale ad elevata velocità. Il metodo d’analisi è basato su un set di 100 differenti microsfere, ognuna caratterizzata da una specifica combinazione di due fluorofori diversi. I campioni vengono prelevati da una piastra da 96 pozzetti che viene caricata in un alloggiamento dedicato dello strumento e spostata automaticamente.
Optima MAX-XP
Beckman Coulter è un’ultracentrifuga da banco ideale per la purificazione e l’isolamento di proteine o la separazione di composti ad alto peso molecolare, virus, nanoparticelle e frazioni subcellulari. È inoltre progettata per la veicolazione genica mediante vettori virali. Lo strumento raggiunge velocità di rotazione molto elevate, fino a 150.000 rpm, con un’accelerazione massima di 1.019.000 × g. Offre un’ampia gamma di volumi di centrifugazione, da 175 µL a oltre 100 mL, e integra un’unità di refrigerazione per mantenere temperature costanti e preservare l’integrità dei campioni termolabili durante le operazioni. Optima MAX-XP supporta vari tipi di tubi e rotori, garantendo flessibilità di configurazione in base alle specifiche applicazioni.
Optima MAX-XP
Beckman Coulter è un’ultracentrifuga da banco ideale per la purificazione e l’isolamento di proteine o la separazione di composti ad alto peso molecolare, virus, nanoparticelle e frazioni subcellulari. È inoltre progettata per la veicolazione genica mediante vettori virali. Lo strumento raggiunge velocità di rotazione molto elevate, fino a 150.000 rpm, con un’accelerazione massima di 1.019.000 × g. Offre un’ampia gamma di volumi di centrifugazione, da 175 µL a oltre 100 mL, e integra un’unità di refrigerazione per mantenere temperature costanti e preservare l’integrità dei campioni termolabili durante le operazioni. Optima MAX-XP supporta vari tipi di tubi e rotori, garantendo flessibilità di configurazione in base alle specifiche applicazioni.
2. Area Biologia Molecolare
Thermal cycler - Digital droplet PCR e real-time PCR
NanoReady Touch FC-3100
Hangzhou LifeReal Biotechnology è uno spettrofotometro compatto progettato per la quantificazione di acidi nucleici, proteine, colture cellulari e batteriche, nonché per la misurazione dell’assorbanza di campioni di concentrazione sconosciuta. Lo strumento copre l’intero spettro UV-Vis, consentendo letture a diverse lunghezze d’onda e sfrutta una tecnologia di lettura a microvolume, che richiede un campione nell’ordine di pochi microlitri applicato direttamente sul sensore. È dotato di un’interfaccia touchscreen che permette di eseguire tutte le funzioni di analisi senza la necessità di collegare un computer, visualizzare i risultati in tempo reale, archiviare i dati ed esportarli successivamente.
NanoReady Touch FC-3100
Hangzhou LifeReal Biotechnology è uno spettrofotometro compatto progettato per la quantificazione di acidi nucleici, proteine, colture cellulari e batteriche, nonché per la misurazione dell’assorbanza di campioni di concentrazione sconosciuta. Lo strumento copre l’intero spettro UV-Vis, consentendo letture a diverse lunghezze d’onda e sfrutta una tecnologia di lettura a microvolume, che richiede un campione nell’ordine di pochi microlitri applicato direttamente sul sensore. È dotato di un’interfaccia touchscreen che permette di eseguire tutte le funzioni di analisi senza la necessità di collegare un computer, visualizzare i risultati in tempo reale, archiviare i dati ed esportarli successivamente.
CFX Opus 96 Real-Time PCR System
Consente l’analisi della struttura secondaria delle proteine mediante dicroismo circolare, fornendo informazioni fondamentali sulla loro conformazione e stabilità. Grazie all’elevata sensibilità e precisione, è ideale per valutare variazioni strutturali dovute da mutazioni, interazioni con ligandi, effetti di temperatura o pH, e processi di denaturazione.
3. Area Trascrittomica
BD Rhapsody™ Single cell RNA analysis system
Permette di analizzare l’intero trascrittoma delle singole cellule, così come quello di TCR e BCR. Questo tipo di analisi fornisce informazioni riguardanti i principali geni e pathways attivati nei diversi clusters cellulari. Consente inoltre di analizzare il tipo e l’intensità delle comunicazioni cellulari che si instaurano tra i clusters.
BD Rhapsody™ Single cell RNA analysis system
Permette di analizzare l’intero trascrittoma delle singole cellule, così come quello di TCR e BCR. Questo tipo di analisi fornisce informazioni riguardanti i principali geni e pathways attivati nei diversi clusters cellulari. Consente inoltre di analizzare il tipo e l’intensità delle comunicazioni cellulari che si instaurano tra i clusters.
4. Area Imaging
Apparecchiatura per acquisizione di immagini ChemiDoc
Il ChemiDoc Go Imaging System di Bio‑Rad è un sistema compatto e ad alte prestazioni per l’imaging di gel elettroforetici e Western blot. È dotato di una fotocamera CMOS da 20,4 MP raffreddata, che assicura immagini ad alta risoluzione e una gamma dinamica estesa (>4 ordini di grandezza), ideale per chemiluminescenza, fluorescenza, Stain-Free e colorimetria.
MICA WideFocal Live Cell (Leica Microsystems)
La tecnologia FluoSync del MICA consente l’acquisizione contemporanea di 4 segnali in fluorescenza tradizionale (unicità assoluta) e confocale. La simultaneità dei segnali in fluorescenza standard, permette di lavorare in condizioni fisiologiche non ottenibili con altre tecnologie non confocali.
Riuscire a catturare fino a 4 segnali in simultanea e perfettamente separati in microscopia a fluorescenza standard significa il non trasferire l’esperimento su piattaforma confocale, eliminando la fototossicità tipica di un sistema confocale standard.
Il MICA consente il passaggio tra microscopia a fluorescenza e confocale point scanning con estrema facilità potendo variare a seconda delle esigenze applicative tipiche del nostro progetto.
Queste le caratteristiche tecnologiche presenti tutte nel sistema il MICA:
Microscopia in campo chiaro – scansione di vetrini tipo scanner
Microscopia con contrasto di modulazione – alternativa al contrasto di fase per imaging di cellule no fluo
Microscopia a fluorescenza tradizionale
Microscopia a Fluorescenza Thunder – a maggiore risoluzione
Microscopia Confocale a 4 canali point scanning
Microscopia Confocale Lightning – a maggiore risoluzione
MICA WideFocal Live Cell (Leica Microsystems)
La tecnologia FluoSync del MICA consente l’acquisizione contemporanea di 4 segnali in fluorescenza tradizionale (unicità assoluta) e confocale. La simultaneità dei segnali in fluorescenza standard, permette di lavorare in condizioni fisiologiche non ottenibili con altre tecnologie non confocali.
Riuscire a catturare fino a 4 segnali in simultanea e perfettamente separati in microscopia a fluorescenza standard significa il non trasferire l’esperimento su piattaforma confocale, eliminando la fototossicità tipica di un sistema confocale standard.
Il MICA consente il passaggio tra microscopia a fluorescenza e confocale point scanning con estrema facilità potendo variare a seconda delle esigenze applicative tipiche del nostro progetto.
Queste le caratteristiche tecnologiche presenti tutte nel sistema il MICA:
Microscopia in campo chiaro – scansione di vetrini tipo scanner
Microscopia con contrasto di modulazione – alternativa al contrasto di fase per imaging di cellule no fluo
Microscopia a fluorescenza tradizionale
Microscopia a Fluorescenza Thunder – a maggiore risoluzione
Microscopia Confocale a 4 canali point scanning
Microscopia Confocale Lightning – a maggiore risoluzione
Zeiss Axio Vert.A1 FL-LED Inverted Microscope
Carl Zeiss è un microscopio invertito a fluorescenza progettato per l’osservazione di cellule vive o fissate in piastre, flask o camere di coltura. Lo strumento è dotato di un sistema ottico con illuminazione LED multicanale per fluorescenza, che consente di eccitare fluorofori a lunghezze d’onda specifiche e visualizzare i relativi marcatori fluorescenti. Grazie agli obiettivi a lunga distanza di lavoro, è ideale per applicazioni di biologia cellulare come il monitoraggio morfologico, l’imaging di colture cellulari, la trasfezione e i controlli di espressione genica. Il sistema è completato dalla fotocamera digitale Zeiss Axiocam 208 color per la cattura e l’archiviazione delle immagini.
5. Area Citometria
BD FACSymphony™ A1 Multicolor Flow Cytometer
E’ un citofluorimetro dotato di 4 laser: blue (488 nm), violet (405 nm), yellow-green (561 nm) e red (637 nm).
La sua configurazione permette analisi cellulari multiparametriche combinando fino a 16 fluorescenze (18 parametri). La possibilità di utilizzare fluorocromi particolarmente brillanti consente di identificare antigeni espressi a bassa intensità e popolazioni cellulari rare.
BD FACSymphony™ A1 Multicolor Flow Cytometer
E’ un citofluorimetro dotato di 4 laser: blue (488 nm), violet (405 nm), yellow-green (561 nm) e red (637 nm).
La sua configurazione permette analisi cellulari multiparametriche combinando fino a 16 fluorescenze (18 parametri). La possibilità di utilizzare fluorocromi particolarmente brillanti consente di identificare antigeni espressi a bassa intensità e popolazioni cellulari rare.
6. Area Spettrofotometria
Cytiva Biacore T200
Il Biacore T200 è un sistema avanzato basato sulla risonanza plasmonica di superficie (SPR) che consente l’analisi in tempo reale e senza marcatori di interazioni biomolecolari (proteine, anticorpi, piccole molecole, virus) con straordinaria sensibilità e precisione.
INNO-S
LTek Microplate Reader è un lettore multimodale progettato per la misurazione dell’assorbanza, della fluorescenza e della luminescenza di campioni in diversi formati di piastra (6-384 pozzetti). Lo strumento utilizza un monocromatore per la lettura UV-Vis (200-999 nm) senza filtri, con selezione della lunghezza d’onda a incrementi di 1 nm. È dotato di rilevazione tramite fotodiodo per l’assorbanza e fotomoltiplicatore per la luminescenza e la fluorescenza. INNO-S dispone di incubazione fino a 50°C, agitazione lineare e orbitale a diverse velocità e doppio iniettore per reagenti. Il sistema consente un’ampia gamma di applicazioni come saggi ELISA, quantificazione di acidi nucleici e proteine, studi di cinetica enzimatica, saggi di fluorescenza a tempo risolto (TR-FRET) e test di vitalità cellulare.
INNO-S
LTek Microplate Reader è un lettore multimodale progettato per la misurazione dell’assorbanza, della fluorescenza e della luminescenza di campioni in diversi formati di piastra (6-384 pozzetti). Lo strumento utilizza un monocromatore per la lettura UV-Vis (200-999 nm) senza filtri, con selezione della lunghezza d’onda a incrementi di 1 nm. È dotato di rilevazione tramite fotodiodo per l’assorbanza e fotomoltiplicatore per la luminescenza e la fluorescenza. INNO-S dispone di incubazione fino a 50°C, agitazione lineare e orbitale a diverse velocità e doppio iniettore per reagenti. Il sistema consente un’ampia gamma di applicazioni come saggi ELISA, quantificazione di acidi nucleici e proteine, studi di cinetica enzimatica, saggi di fluorescenza a tempo risolto (TR-FRET) e test di vitalità cellulare.
7. Area Elettrofisiologia
Electrophysiology apparatus
Il Biacore T200 è un sistema avanzato basato sulla risonanza plasmonica di superficie (SPR) che consente l’analisi in tempo reale e senza marcatori di interazioni biomolecolari (proteine, anticorpi, piccole molecole, virus) con straordinaria sensibilità e precisione.
