Determinare il peso molecolare è essenziale per garantire, in via preliminare, l’identità del prodotto. Differenze di peso molecolare possono indicare potenziali variazioni di sequenza e fornire una valutazione delle modifiche post-traduzionali, inclusa la glicosilazione.

L’analisi di massa intatta è uno strumento fondamentale che può essere utilizzato come primo passo per la caratterizzazione di prodotti biologici, per controllare la qualità di produzione, per esaminare il grado di glicosilazione, la coniugazione, la frammentazione ed altre modifiche.

• Massa intatta per definizione preliminare dell’identità
• Massa intatta per definire la presenza di proteoforme e loro abbondanza relativa

La mappatura dei peptidi costituisce una parte importante dell’analisi della struttura delle proteine poiché consente di confermare la sequenza primaria del prodotto e anche di indagare una varietà di modificazioni post-traduzionali potenzialmente rilevanti per l’efficacia e sicurezza del prodotto stesso, tra cui: deamidazione, ossidazione, acido piroglutammico N-terminale, clippaggio della lisina C-terminale e glicosilazione.

• Peptide mapping con enzima singolo o multienzima (ricopertura aminoacidica > 95%)
• Peptide mapping per definire la posizione delle singole modifiche

Durante lo sviluppo di farmaci bioterapeutici è richiesta la caratterizzazione di un ampio range di proprietà biofisiche per supportare il processo decisionale e fornire un pannello di evidenze robuste agli enti regolatori. Molecole complesse, come le proteine, presentano sfide tecnologiche e analitiche significative con attributi di qualità come la High Order Structure (HOS), che si potrebbe definire come l’effetto sinergico della struttura secondaria, terziaria e quaternaria responsabile della corretta conformazione della macromolecola. HOS è normalmente caratterizzata grazie ad una varietà di tecniche analitiche biofisiche, tra cui il Dicroismo Circolare, che, oltre all’analisi delle proprietà strutturali delle biomolecole e dei composti otticamente attivi, si utilizza per lo studio di variazioni conformazionali delle proteine durante le interazioni con sostanze (inibitori, analoghi di substrato, ecc) o a causa di esse (ad es. agenti denaturanti).

• Analisi spettrale per definire % di alfa-elica e foglietto-beta nella proteina.

L’aggregazione e la formazione di prodotti di degradazione (frammenti), così come l’eterogeneità delle varianti di carica, sono caratteristiche fondamentali implicate nella stabilità, nell’attività biologica e nell’immunogenicità di prodotti biotecnologici. Le condizioni di produzione, manipolazione e conservazione possono variare la composizione del prodotto, che è necessario indagare da un punto di vista sia qualitativo sia quantitativo.

Grazie alla sua comprovata robustezza e versatilità, la cromatografia liquida (LC) è ampiamente utilizzata nel controllo qualità. Tra le diverse modalità cromatografiche, la cromatografia a fase inversa (RP), la cromatografia a scambio ionico (IEX) e la cromatografia a interazione idrofila (HILIC) sono le più frequentemente impiegate per la caratterizzazione e il controllo dei biofarmaci, in combinazione con rivelatori UV e MS.

L’elettroforesi capillare (CE) è una tecnica versatile che offre separazioni rapide con eccezionale efficienza e risoluzione. La CE può rappresentare un’alternativa flessibile ed efficiente alla cromatografia liquida (LC) per affrontare complesse sfide analitiche.

La cromatografia liquida a fase inversa accoppiata a un rivelatore UV (RP-LC/UV) viene utilizzata principalmente per la conferma dell’identità di prodotti biotecnologici mediante mappa peptidica o analisi di proteine ​​intatte. La struttura primaria delle proteine ​​(sequenza di amminoacidi e modificazioni post-traduzionali) determina la struttura di ordine superiore delle proteine ​​(ovvero, strutture secondaria, terziaria e quaternaria). Pertanto, la conferma della struttura primaria è fondamentale per la caratterizzazione strutturale di proteine e per il confronto tra originator e biosimilare.

Le varianti di carica possono essere separate cromatograficamente mediante analisi a scambio ionico (IEX). La cromatografia a scambio cationico e anionico può essere utilizzata come metodo di riferimento per il controllo qualità di proteine ricombinanti.

La cromatografia di interazione idrofila (HILIC) è una tecnica di separazione potente per proteine e peptidi polari, ideale per analizzare glicoproteine e fosfoproteine. Utilizza una fase stazionaria polare e un’eluizione in fase mobile organica/acquosa, altamente compatibile con la spettrometria di massa (ESI-MS) consentendo un’elevata sensibilità, spesso offrendo una selettività complementare alla fase inversa (RP-LC).

L’elettroforesi capillare (CE) nella modalità zonale (CZE) è in grado di realizzare, con un minimo consumo di campioni e di solventi, la separazione di varianti di carica di proteine e anticorpi, derivanti da PTMs (lisinaC-terminale, glicosilazione, deamidazione). La separazione avviene in base alle differenze di mobilità delle PTMs, dovute sia alla carica (in un intervallo di pI da 7.4 a 9.5) sia al raggio idrodinamico dell’analita. Si possono ottenere dettagliate fingerprints applicabili ad un confronto del prodotto originator/biosimilar o a studi di stabilità.

L’elettroforesi capillare (CE) separa monomeri proteici da aggregati presenti in miscela: nella modalità CZE in base alle differenze del raggio idrodinamico, nella modalità CE-SDS (o CGE) in base a un meccanismo setaccio. Ortogonale a SEC-UV.

La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC-HPLC) è una tecnica fondamentale per separare aggregati (composti ad alto peso molecolare) e frammenti (baso peso molecolare) di proteine o biomolecole in base al loro volume idrodinamico. La SEC utilizza, principalmente, come tecnica di rivelazione la spettroscopia ultravioletta (UV) e rappresenta un metodo relativo per la determinazione dei pesi molecolari, che richiede standard di calibrazione. Un rivelatore più recente e assoluto prevede l’utilizzo della diffusione della luce multi-angolo (MALS), che non necessita di standard.